近期，四川新生命干细胞科技股份有限公司研发团队（以下简称“公司研发团队”）发明的“一种可用于同种异体回输的高纯度NK体外扩增方法”已向国家知识产权局申请发明专利并获得受理（以下简称“本发明专利方法”），有望在抗击恶性肿瘤的治疗中发挥重要作用。

　　NK细胞（自然杀伤细胞）作为机体防御体系的第一道防线，不仅可以在天然免疫系统发挥其主要杀瘤效应，而且在免疫反应的早期还可以分泌不同的细胞因子和各种趋化因子来调节机体的获得性免疫应答，是机体发挥免疫效应不可或缺的效应细胞。

　　近年来，NK细胞因其细胞杀伤活性高，起效快，且不受人主要组织相容性复合体(MHC)限制等优点，相对其它用于免疫治疗的细胞受到了更广泛的关注和临床应用。但是NK细胞在外周血中仅占淋巴细胞的10%-15%，在脐带血中的含量更低，只有5%左右，其数量和纯度尚不能满足临床治疗的需要。

　　经过反复实验，公司研发团队通过对传统方法的改进和优化，发明了一种操作步骤相对简便，安全高效的可用于同种异体回输的高纯度NK体外扩增方法，该方法的优势主要体现在：

图1不同分离方法分离纯化NK细胞的效果， A分离纯化前NK细胞所占淋巴细胞的比率，B用Ficoll淋巴细胞分离液

　　分离方法分离纯化后NK细胞所占淋巴细胞的比率，C本发明专利方法分离纯化后NK细胞所占淋巴细胞的比率

　　1、纯度高

　　本发明专利方法与传统的Ficoll淋巴细胞分离液分离方法相比，分离获得的NK细胞纯度可达98%以上，操作步骤简单，减少了中间环节污染的可能性，分离纯化的操作时间也由4小时降低至1小时左右（见图1）；培养14天后，本发明专利方法本发明专利方法培养的NK细胞阳性率高达99.8%，显著高于传统方法的55.4%（见图2）。

　　本发明专利方法所制备的NK细胞，排除了T细胞，Treg细胞，B细胞的污染，对肿瘤细胞的杀伤活性高，可满足美国NHLBI（National heart, lung and blood Insititute）用于同种异体回输的标准（CD3-CD56+NK细胞达到90%以上，CD19+B细胞和CD3+T细胞低于5%），不但可用于自体NK回输，也可以用于同种异体NK的回输。

图2 培养14天CD3-CD56+NK细胞的阳性率，A传统方法、B本发明专利方法

　　2、安全可靠

　　本发明专利方法创造性的使用Herceptin（赫塞汀）作为包被物来激活NK细胞，因此在培养过程中不再依赖于传统方法所必需的饲养细胞,杜绝了异源生物污染，提高了使用安全性，同时避免了回输后由于体内和体外环境的差异对NK细胞在体内的扩增和杀伤活性的影响。同时，其分离纯化及体外扩增时间短；而且操作简单，减少了中间环节污染的可能性。

　　3、扩增倍数高

　　本发明专利方法可以从外周血或脐带血中高效扩增NK细胞，可使其扩增200-1000倍，获得满足临床使用的NK细胞（见图3）。

图3 扩增培养14天NK细胞的扩增倍数

图4 扩增培养14天NK细胞对恶性肿瘤细胞K562的杀伤活性，A、B传统方法，C、D本发明专利方法

　　4.杀伤活性强

　　本发明专利方法所制备的NK细胞在靶效比1:1、1:2时，对恶性肿瘤细胞K562的杀伤效率均显著优于传统方法制备的NK细胞（1:1时，C本发明专利方法66.4%>A传统方法19.3%；1:2时，D 本发明专利方法84.6%>B传统方法25.8%）。

　　综上所述，本发明专利方法提供的NK细胞分离培养方法，可以从外周血或脐带血中高效获得满足临床使用的NK细胞，细胞数量多、纯度高、杀伤活性好，在同种异体NK回输方面具有突出优势，而且本发明专利方法操作简单、分离培养时间短，具有良好的应用前景。